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1.中国矿业大学（北京）煤炭资源教育部重点实验室及资源与地球科学系 2. Cardiff University, UK

 

 

摘要：本文使用质粒DNA评价法（plasmid DNA assay）和电感偶合等离子体质谱（ICP-MS）研究了北京市室内外PM₁₀的生物活性及其与微量元素的关系。本研究选择了6组样品分别代表室内和相应室外进行质粒DNA评价研究。结果表明，厨房内采集的PM₁₀的TD50 (50%的DNA被破坏时的PM₁₀的剂量) 最低，为45µg mL^-1，对DNA的损伤最大，表明具有最高的生物活性。而两个抽烟室内采集到的PM₁₀的TD50分别为100和263µg mL^-1，具有较强的生物活性。结合ICP-MS得到的微量元素结果分析发现， PM₁₀的水溶性Zn与TD50较其它元素相比具有更好的负相关性，说明水溶Zn可能造成DNA的氧化性损伤的主要原因。

 

关键词：质粒DNA评价 生物活性 微量元素 室内空气 可吸入颗粒物（PM₁₀）

 

近年来，PM₁₀对人体的损伤效应引起了广泛的关注，流行病学研究结果表明PM₁₀浓度的增加与人们发病率及死亡率之间有显著的相关性^{[1, 2]}。关于颗粒物的肺损伤目前被广泛接受的观点是颗粒物表面的生物可利用的重金属离子会产生自由基，这些自由基对关键细胞的氧化性损伤可能是颗粒物导致肺损伤的主要原因^[3-7]。Wilson等^[8]通过有过渡金属和没有过渡金属两种情况下的炭黑和超细炭粒子的自由基及致炎作用的研究，证明PM₁₀中的过渡金属对肺具有氧化性损伤。

 

McNeilly等^[9]利用体外实验的方法证明水溶性重金属会导致炎症。Richards等^[10]研究表明导致肺损伤的是可溶的而非不可溶的锌；Adamson等^[11]利用活体实验研究发现，造成老鼠肺损伤的是水溶Zn。王玉秋等^[12]研究发现Fe是典型介导氧自由基过程的重金属。中国矿业大学（北京）环境与健康课题组的研究表明对DNA产生氧化性损伤的是颗粒物中的水溶性组分，其中水溶性的Zn元素可能是对DNA氧化性损伤的主要重金属元素^{[13, 14]}，并提出吸烟室内可吸入颗粒物比不吸烟室内可吸入颗粒物具有更强毒性^[15]。本文利用质粒DNA评价法对居室室内PM₁₀样品的生物活性进行研究，并利用ICP-MS对PM₁₀的微量元素进行研究，最后判别不同类型室内PM₁₀的氧化性损伤能力强弱以及可能导致这种损伤能力的重元素类型。

 

 

 

2003年7月在北京市2户（吸烟，非吸烟家庭）客厅、厨房(烹饪时)各采样3天，每天连续采样8小时以上。采样点位于中国矿业大学附近，由于条件限制，所以只在白天居民正常的生活条件下进行采样。同时在室外采集PM₁₀样品，避免雨天。采样仪空气流速为30 L/min，采样头距地面高度为1.5m左右。随时记录室内外温度、湿度及风速。本次实验的采样头为Negretti（UK）PM₁₀切割器，所用滤膜为直径47mm，孔径0.6µm聚碳酸酯滤膜（Millipore, UK）。

 

 

质粒DNA评价法是一种研究颗粒物表面的自由基对超螺旋DNA产生氧化性损伤的体外方法^[13-16]。基本原理是颗粒物表面携带的自由基对超螺旋DNA产生氧化性损伤，最初的损伤是引起超螺旋DNA松弛；进一步的损伤表现为使DNA线化。这种损伤变化引起DNA在电泳仪中的电泳淌度的变化，进而将不同形态的DNA在琼脂糖凝胶中分离开，并在专门软件中进行定量分析，以此来评价颗粒物的生物活性（图1）。具体实验步骤参见文献^[13]，首先将颗粒物从滤膜上分离出来后，使用超纯水将样品稀释成4-5个不同的浓度级别，分别与一定量的质粒DNA(φX174-RF DNA, Promega, London, UK)进行混合并使其充分反应，然后将混合溶液置入电泳槽凝胶中，使用电泳仪在30V电压下通电16小时，将不同形态的DNA分离开来，最后使用紫外凝胶成像系统（Synoptics LTM, Cambridge, UK）对凝胶成像，并使用Syngene Genetools软件（Synoptics Ltd.）和光密度计对凝胶体中的超螺旋、松弛的及线化的等不同形态的DNA进行半定量分析，其中松弛和线化的DNA占总DNA的比例即代表样品的氧化性损伤能力或生物活性，其中一个重要的参数TD50，它代表造成50%的DNA损伤所需的样品的剂量（toxic dose），TD50值越小，颗粒物生物活性越大。

 

使用ICP-MS进行颗粒物中微量重金属元素进行分析。对水溶部分微量元素的测量，是将滤膜放入10mL HPLC级水中，使用涡旋混合器震荡6小时；然后使用0.2m孔径的聚碳酸酯滤膜（Millipore）过滤，即为水溶部分样品；从制备好的溶液中取出1mL，与0.5mL的50ppb铑标准液混合，并加入2%硝酸至5mL；使用ICP-MS（Perkin Elmer Elan 5000）进行化学成分分析。

 

 

 

本次选择六个样品中，No.1为厨房中采集到的PM₁₀，其质量浓度为205.9µg m^-3；No.2和No.3为两个吸烟室内PM₁₀，其质量浓度分别为51.1µg m^-3和611.1µg m^-3；No.4和No.5为非吸烟室内的PM₁₀，质量浓度分别为29.3和91.2µg m^-3；No.6为相应的室外PM₁₀，其质量浓度为38.8µg m^-3。六组样品对超螺旋DNA损伤的定量分析结果如图2所示，其TD50值见图3。从图3可以看出，厨房中采集到的PM₁₀样品 (No.1) 对DNA的氧化性损伤最大，其TD50低达45µg mL^-1，当其剂量为75µg mL^-1时，就有97.8%的DNA被破坏，而且当剂量再增加时，DNA的破坏量略有增加 (图2)。吸烟的室内PM₁₀对DNA的损伤较非吸烟室内和室外PM₁₀的损伤大，TD50为100和263µg mL^-1；非吸烟室内No.4样品在250µg mL^-1的浓度下造成的损伤为60%，而在125µg mL^-1时，损伤为17%，所以其TD50在125~250µg mL^-1之间，而No.5样品即使在浓度为500µg mL^-1对DNA的损伤才达38%，说明其生物活性较小；室外No.6样品在250µg mL^-1 时对DNA的损伤达30%，TD50为415µg mL^-1。很明显，厨房中采集到的PM₁₀样品的TD50值最小，表明其生物活性最大，吸烟室内的样品次之，具较强的生物活性。笔者曾针对前四个样品的实验结果证明吸烟家庭的可吸入颗粒物比不吸烟家庭的可吸入颗粒物有更高的生物活性^[15]，本次将新做的厨房可吸入颗粒物的实验结果加入数据组，结果显示厨房采集的可吸入颗粒物生物活性及毒性相对最高。

 

 

为说明引起质粒DNA损伤的主要原因，我们将4组样品的TD50值与这些样品的水溶性组分中的主要重金属元素As、Cu、Ni、Pb、Zn等的含量进行相关分析（图4）（为了便于比较，No.4的TD50介于125~250µg mL^-1，值取200µg mL^-1；No.5的TD50取600µg mL^-1）。

 

从图4可以看出，虽然As、Cu、Ni、Pb在水溶组分中含量较高，但是它们与样品的TD50值并没有对应相关关系，说明这些元素可能不是造成质粒DNA损伤的主要元素。比较有意思的是Zn元素，从图4可看出水溶组分中Zn元素的含量与TD50值呈明显的负相关关系，即Zn含量越高，样品造成的DNA损伤越大。水溶性的Zn在No.2 (吸烟室内) 样品的含量最高，其TD50值也最小，这表明水溶性的Zn可能是PM₁₀造成DNA损伤的重要重金属元素。

 

图2  PM₁₀对DNA损伤的定量统计直方图，其中线化和松弛的DNA的相对含量总和代表损伤量

 

 (a)厨房内(No.1); (b)吸烟室内(No.2); (c)吸烟室内(No.3); (d)非吸烟室内(No.4);(e) 非吸烟室内(No.5); (f)室外(No.6)